Das Problem mit der Tiefenschärfe /Schärfentiefe 1!

Jeder der mikroskopiert, kennt dieses Problem, welches sich mit zunehmendem Abbildungsmaßstab und n Apertur des jeweils eingesetzten Objektivs verstärkt. Das jeweilige Objektiv löst nur in "EINER" Ebene scharf auf, alles was darüber oder darunter liegt wird mehr oder weniger unscharf dargestellt! Man hat das Gefühl immer nur einen Teil des Objektes zu sehen und fokussiert entsprechend rauf oder runter. Nun dieses Problem lässt sich so nicht beseitigen und muss hingenommen werden!

Aber, in Zeiten der Computer- und Digitaltechnik lässt sich dieses Problem zumindest mittels Fotografie - am besten über eine Digitalkamera am Mikroskop - so wie Software einigermaßen geschickt lösen.

Aufgerüttelt durch einen Artikel im neuen Mikrokosmos- Heft "September 2003, Jahrgang 92, Heft 5 ab Seite 305" in welchem Herr Dr. Norbert Lange zwei Programme vorstellte, die zum einen kostenlos und von jedermann aus dem Internet geladen und genutzt werden können, machte ich mich sofort an den Download der beiden Programme. Aber dazu später mehr!

Der Trick besteht einfach in der Tatsache, dass man, angefangen von der untersten Ebene, nach oben fokussierend so viele Bilder anfertigt, bis die oberste Ebene erreicht ist! Die so entstandenen Aufnahmen werden dann mittels Software einfach ineinander  kopiert!

Doch zunächst einmal zum Verständnis zwei Testbilder eines zufällig in einer Probe gefundenen Insektenbeinstücks, welches, wie sich rausstellte, sehr gut dazu geeignet ist diesen Trick anschaulich zu verdeutlichen!
Dieser kleine Bildausschnitt aus einer der Originalaufnahmen zeigt deutlich das Problem der fehlenden Tiefenschärfe (Schärfentiefe?). Nur ein ganz kleiner Ebenenteil ist hier wirklich scharf alles andere hingegen unscharf. Da, gerade bei Lebenduntersuchungen von Protozonen diese ja nicht auf "eine" Ebene platt gedrückt werden können und sich somit in drei Dimensionen im umgebenden Medium bewegen, selbst aber ebenfalls einen dreidimensionalen Körperbau aufweisen, wie eben auch das nebenstehend abgebildete Insektenbeinstück, gelingt es mit dem Mikroskop kaum, diese Körper im Ganzen scharf über das Objektiv abbilden zu lassen, je nach Durchmesser funktioniert dies nur mit sehr kleinen Objektiven und meist auch nur dann, wenn es ruhig an einer Stelle im Medium liegt. Bewegt es sich auch noch nach unten oder oben hat man selbst mit diesen Objektiven oft Schwierigkeiten, das Objekt komplett scharf zu fokussieren und unbedacht der Tatsache des meist zu kleinen Abbildungsmaßstabes. Doch, wie oben bereits besprochen, falls man eine Digitalkamera an sein Mikroskop adaptiert hat, liegt es förmlich auf der Hand, mehrere Fotos aus verschiedenen Ebenen aufzunehmen und somit bestimmte Einzelheiten auch in der Tiefe bzw. Höhe scharf zu erfassen und anschließend zu betrachten. Aber, es ist eben immer nur "EINE" Ebene die wir sehen. Wie schön wäre es dagegen das ganze Objekt scharf betrachten zu können. Das es funktioniert, zeigt das folgende Bild.
Der Klarheit halber und um unnötigen Ballast außen vor zu lassen, habe ich das Objekt einfach auf einen blauen Hintergrund kopiert. Das es die "Zauberstabfunktion" meiner Bildbearbei-tungssoftware etwas zu gut gemeint hatte, soll hier dem Ganzen keinen Abbruch tun. Deutlich sind nun fast alle Schärfenebenen (15 Bilder) zu einem scharfen Ganzen zu-sammengesetzt wor-den. Fast jedes einzel-ne Haar ist hier klar und scharf sichtbar. Sogar die winzigen Segmente in der klei-nen Kieselalge scheinen nun plastisch und deutlich hervor zu tre-ten. Leicht kann man sich nun vorstellen, dass das Bein rund und dreidimensional ist.

Aber wie und womit funktioniert das nun? Herr Dr. Lange hatte im o.a. Artikel zwei Adressen genannt und zwei Programme vorgestellt. Zum einen ein Programm aus der Astronomie. AstroStack2, zu laden unter http://www.astrostack.com zum anderen um das Programm CombineZ 3, welches speziell für die Mikroskope geschrieben wurde. Zu laden unter: http://www.hadleyweb.pwp.blueyonder.co.uk/CombineZ/combinez.htm - dies gibt es in der zwischenzeit bereits in neuerer Fassung als CombineZ 4 - zu laden unter: http://www.microscopy-uk.net/index.html auf dieser Seite unter Software nachschauen. Da diese Seiten ständig umgebaut werden, kann für die Richtigkeit des obigen Links keine Gewehr übernommen werden. Notfalls per Google oder anderer Suchmaschine nach CombineZ4 suchen!

Beide Programme sind in englischer Sprache. AstroStack bzw. dessen Arbeitsweise konnte sich mir nicht auf Anhieb erschließen, so dass ich mich vornehmlich mit CombineZ 4 beschäftigt habe und auch obige Testaufnahme damit konstruierte. Es lässt sich leicht bedienen, muss nicht installiert werden und ist unter Windows > 95 sofort lauffähig! Man kann sofort loslegen! Zunächst erstellt man mehrere Fotos! Je mehr um so besser! Mein Laboval 2 hat leider keine Noniusskala am Tischtrieb, womit ein exakter und reproduzierbarer Ebenenfokus eher zufällig und ganz auf die feinfühlige Hand angewiesen, entsteht. Ein genaues Beobachten des auf dem Bildschirm wiedergegebenen Bildes jeder einzelnen Ebene ist daher ein notwendiges Novum. Damit sich das Bild von unten nach oben aufbauen kann, fährt man den Tischtrieb zunächst in die tiefste Ebene in der das Objekt gerade noch unscharf erkennbar ist. Nun arbeitet man sich mittels Tischtrieb vorsichtig nach oben durch das Objekt und macht von jeder Ebene eine Aufnahme. Im obigen Beispiel habe ich insgesamt 15 Aufnahmen gemacht.

Nachdem dies geschehen ist und die Aufnahmen in einem Ordner auf der Festplatte gesammelt und von 1 beginnend durchnummeriert sind, kann man CombineZ 3 oder CombinZ 4 aufrufen. Über die Programmleiste begibt man sich unter Datei mit der Maus auf den Menüpunkt "New", worauf hin der Explorer aufgerufen wird, in welchem man nun nach den vorher angelegten Bildordner sucht. Die darin befindlichen Bilder wählt man alle auf einmal aus und quittiert mit ok! Das Programm CombineZ importiert nun sämtliche Aufnahmen. Unter dem Menüpunkt "Spezial" in der Programmleiste wählt man jetzt nur noch "Do combine", das war's zunächst schon. das Programm rechnet nun alle Bilder mit 1 beginnend ineinander. Was es dabei genau macht, kann ich auf Anhieb nicht sagen, auf jeden Fall hat man auch schon mal ein schwarzes Bild oder ein schwarzes Bild mit grauen Objektteilen usw. Nachdem die Sanduhr wieder zum Mauszeiger geworden ist, ist das Bild fertig! Jetzt nur noch im Datei-Menü unter "Picture/Frame save as" oder unter "Picture/Frame save" auf Platte speichern! Fertig!

Dieses Bild können Sie nun in jeder beliebigen Bildbearbeitungssoftware so weiterverarbeiten, wie Sie es für richtig und gut befinden. Ich werde ab jetzt nach geeigneten Objekten Ausschau halten um ggf. davon entsprechende Schnittaufnahmen zu fertigen. Da es sich bei dem obigen Bild noch um eine Testausnahme handelt hoffe ich in Zukunft und nach vollkommener Kenntnis aller weiteren Programmfunktionen noch bessere Bilder machen zu können, welche ich Ihnen dann hier auf keinen Fall vor enthalten möchte.

Na, selbst Lust auf eigene Aufnahmen bekommen? Nichts wie ran, es scheint wirklich nicht schwer!

Mein besonderer Dank und Anerkennung an den Programmautor Alan Hadley für dieses einfach zu bedienende und kostenfreie Tool, aber auch an den Autor Herrn Dr. Lange für den o.a. Beitrag im Mikrokosmos mit dem Titel: "Verarbeitung von Fokusstapeln in der Mikroskopie" für den interessanten Beitrag garniert mit entsprechend hochwertigen und interessanten Aufnahmen.

1 Tiefenschärfe / Schärfentiefe? Mal steht es in der Literatur so, mal so, was richtig ist, oder ob es zwischen diesen beiden Begrifflichkeiten einen Unterschied gibt und wenn ja welcher, hat sich mir noch nicht ganz erschlossen. Ich persönlich neige dazu dem Wort Tiefenschärfe den Vorrang zu geben, da es meiner Meinung nach das Problem sprechender beschreibt als das Wort Schärfentiefe. Eventuell findet sich ja ein Leser der mich freundlichst darüber aufklärt, was denn nun und warum richtig ist?

 

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